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¹³C-²H双同位素示踪法研究硫酸盐浆中残余木质素的仿酶降解

- ORCID：
张功侠
- ORCID：
路德胜
- ORCID：
陈旭东
- ORCID：
岳园园
- ORCID：
谢益民
✉

湖北工业大学制浆造纸研究院，湖北武汉，430068

中图分类号： TS711

最近更新：2024-01-08

DOI：10.11981/j.issn.1000-6842.2023.04.10

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摘要

本研究合成了松伯醇葡萄糖苷-［α-¹³C］，将其与碳水化合物前驱物D-葡萄糖-［6-²H₂］及苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine Ammonialyas，PAL）的抑制剂羧甲氧基胺半盐酸盐（AOA）投入到处于生长状态的银杏枝条中，得到¹³C和²H双同位素标记的银杏木粉。对银杏木粉进行硫酸盐法蒸煮，所得浆料通过酶水解法分离及纯化后得到¹³C和²H双同位素标记的纤维素酶解木质素（CEL），用GIF-sur-Yvette型（GIF型）以及水杨醛（salicylaldehyde）、乙二胺（ethylenediamine）与铜离子形成的络合物（Cu（Salen））仿酶处理CEL，以进一步除去其中的木质素和木质素-碳水化合物复合体（LCC）。利用核磁共振技术（¹³C NMR和¹H NMR）对仿酶处理后的残余物进行分析，结果表明经GIF型仿酶处理后的残余物中木质素结构单元间主要以β-5、β-O-4、β-1结构连接，少量木质素与纤维素之间以缩醛键和苯甲醚键（约6.7%）连接。Cu（Salen）型仿酶处理后的残余木质素结构单元间主要以β-O-4、β-1结构连接，仿酶处理后的CEL存在少量纤维素，但是没有发现木质素与纤维素之间的苯甲醚键和缩醛键的连接键信号。¹H NMR差示谱图只显示出部分未取代的纤维素多糖信号，未发现木质素与多糖的连接键信号，这表明Cu（Salen）型仿酶对LCC具有较强的降解能力。

关键词

硫酸盐法蒸煮; 残余木质素; 双同位素示踪; 仿酶降解; 银杏

大量研究发现碱法制浆过程中植物纤维原料中的部分木质素-碳水化合物复合体（LCC）连接键相当稳定，未漂浆中的残余木质素与碳水化合物之间存在稳定的化学键连接^［

1］。20世纪80年代，Tanbda等^{［参考文献 2

百度学术}2］通过合成非酚型结构单元的α-苯甲醚键型LCC模型物，并进行碱法蒸煮以研究LCC在制浆过程中的稳定性，研究结果显示，在碱法蒸煮的条件下，LCC之间的非酚型α-苯甲醚键结构十分稳定。Iversen等^{［参考文献 3

百度学术}3］分析了桉木硫酸盐浆中的残余木质素，发现木质素侧链Cα、Cβ、Cγ与多糖形成的醚键能够在蒸煮过程中保持稳定，该部分难以去除的木质素成为阻碍制浆和漂白技术发展的关键问题^{［参考文献 4

百度学术}4］。为了给制浆和漂白过程提供更加高效的脱木质素方法，许多研究者开始研究仿酶降解体系^{［参考文献 5-7}5-7］。仿酶，即人工合成的低分子配位化合物，它具有与酶相似的特性，可以选择性地脱除纸浆中的残余木质素^{［参考文献 8

百度学术}8］。

Cu²⁺/吡啶/过氧化氢构成的GIF-sur-Yvette型（GIF型）仿酶氧化系统是一种模拟漆酶的仿酶体系^［

9］。Barton等^{［参考文献 10

百度学术}10］的研究发现，GIF型仿酶体系的核心机理是将木质素氧化成醛类和羧酸类，从而达到降解木质素的目的。朱正良等^{［参考文献 11-13}11-13］在利用GIF体系降解木质素上做了大量的研究，研究发现，GIF仿酶体系可以选择性地脱除醌式结构、共轭羰基和酚类结构，同时也能降解纸浆中的部分碳水化合物。在各类仿酶体系中，水杨醛（salicylaldehyde）、乙二胺（ethylenediamine）与铜离子形成的络合物（Cu（Salen））型仿酶体系同样受到了研究者的关注^{［参考文献 14

百度学术}14］，其氧化性酶的活化中心为络合铜^{［参考文献 15

百度学术}15］。孙媛芳等^{［参考文献 16

百度学术}16］用Cu（Salen）型仿酶体系降解三倍体毛白杨的磨木木质素（milled wood lignin，MWL）时发现Cu（Salen）型仿酶对木质素的β-O-4醚键、C—C键有较强的降解能力。

上述仿酶降解体系是研究深度脱除木质素和LCC的有效途径，但由于木质素大分子和碳水化合物本身的结构相当复杂^［

17］，其降解机理的研究极为复杂且困难。因此研究人员开始尝试用¹³C同位素示踪法结合核磁共振（¹³C NMR）波谱技术研究木质素结构以及LCC化学键在化学降解过程中的变化，通过提高¹³C的丰度来改善¹³C信号之间的叠加问题^{［参考文献 18

百度学术}18］。杨志勇等^{［参考文献 19

百度学术}19］模拟硫酸盐法蒸煮条件，将合成的愈创木基丙三醇-β-愈创木基醚-［α-¹³C］模型化合物与聚木糖进行蒸煮，然后利用酸液析出并沉淀木质素后用乙酸乙酯抽提等步骤将蒸煮后的产物分离，并通过¹³C NMR表征发现酸不溶物中存在苯甲醚键，而碱不溶物、乙酸乙酯抽提物中并未发现存在该LCC连接键。近年来，Xie等^{［参考文献 20-21}20-21］将¹³C标记的木质素前驱物松伯醇葡萄糖苷-［α-¹³C］和²H标记的纤维素前驱物D-葡萄糖-［6-²H₂］注入到植物中，成功实现了¹³C和²H的选择性标记，为双同位素示踪法结合¹³C NMR和¹H NMR技术研究木质素结构与LCC连接键提供理论支持。

在本研究中，在银杏植株的培育过程中加入带¹³C和²H同位素标记的木质素前驱物（松伯醇葡萄糖苷-［α-¹³C］）和碳水化合物前驱物（D-葡萄糖-［6-²H₂］），待植株培养结束后收集带同位素标记的新生木质部组织，其经硫酸盐法蒸煮^［

22］处理后，所得浆料使用纤维素酶和半纤维素酶水解并纯化，得到¹³C和²H标记的纤维素酶解木质素（CEL），利用GIF型和Cu（Salen）型仿酶体系降解处理CEL，结合¹³C NMR和¹H NMR技术分析残余木质素结构及其与LCC的化学键连接形式。

1 实验

1.1　实验试剂及原料

银杏植株购自武汉江夏苗圃。

松伯醇葡萄糖苷-［α-¹³C］由本实验室合成，D-葡萄糖-［6-²H₂］、纤维素酶“Onozuka”RS购自Sigma公司；半纤维素酶（来源于黑曲霉）购自日本Yakult株式会社；透析袋（1000D）购自美国Scientific Research Special公司。

水杨醛、N-甲基咪唑、吡啶购自麦克林试剂公司，分析纯；乙酸、甲苯、盐酸、氢氧化钠、硫化钠、N，N二甲基甲酰胺、二甲基亚砜（DMSO）、醋酸酐、五水硫酸铜、过氧化氢（30%）、无水乙醇、乙二胺、氯化锂购自国药集团化学试剂有限公司，分析纯。

1.2　CEL的制备与纯化

图1为采用松伯醇葡萄糖苷-［α-¹³C］与多糖前驱物D-葡萄糖-［6-²H₂］同位素标记银杏植株的示意图，银杏植株采用水培方式进行培育，水培法可以精确控制植株的生长和发育过程^［

23］，并且让带有¹³C和²H同位素标记的木质素前驱物和碳水化合物前驱物参与体内的新陈代谢。培育一个月后，得到带有双同位素标记的银杏植株，切取约1 mm厚的新生木质部组织，干燥后经粉碎机磨成40~60目的粉末。取一定量银杏木粉，采用优化后的蒸煮条件^{［参考文献 24

百度学术}24］进行硫酸盐法蒸煮，并用蒸馏水将蒸煮所得浆料洗涤至中性，得到带有¹³C和²H双同位素标记的硫酸盐浆。

图1 生长中的银杏植株的同位素标记

Fig. 1 Isotope labeling of a growing tree of Ginkgo biloba L.

称取一定量的硫酸盐浆用PFI磨打浆至游离度为300 mL，加入纤维素酶、半纤维素酶以及乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH值=4.6），加入3滴甲苯做保护剂，45 ℃下在水浴震荡反应器中培养48 h，离心分离沉淀后再经冷冻干燥得到CEL，经过酶处理后大幅度降低了样品中的半纤维素含量并提高了半纤维素的溶出率^［

25］。参考Chang等^{［参考文献 26

百度学术}26］的方法将酶解后的粗CEL在氮气的保护下用1 mol/L的NaOH抽提2 h。离心分离不溶物与上清液，在得到的上清液中加入稀盐酸（1/3，V/V）调节pH值为2.5，析出沉淀后分离沉淀并溶解于NaOH（2 mol/L）溶液中，在70 ℃下振荡48 h，加入冰醋酸调节pH值至中性，再将溶液移至透析袋（M_wCO∶1000 D）中，分别经蒸馏水透析48 h、稀醋酸透析24 h、蒸馏水再次透析24 h后，冷冻干燥得到纯化CEL。图2、图3分别为CEL的制备和纯化流程图^{［参考文献 27

百度学术}27］，整个纯化过程可以很好地去除失活的酶蛋白^{［参考文献 28

百度学术}28］。

图2 粗CEL的制备

Fig. 2 Preparation of crude CEL

图3 CEL的纯化

Fig. 3 Purification of CEL

1.3　Cu（Salen）配合物的合成

Cu（Salen）配合物的合成路线如图4所示。在250 mL三口烧瓶中加入60 mL质量分数为85%的乙醇溶液和12.2 g水杨醛，75 ℃下搅拌溶解。待完全溶解后，向三口烧瓶内滴加3.1 g乙二胺溶液，反应2 h后冷却至20 ℃。反应结束后，过滤得到不溶物，用质量分数为60%的乙醇溶液反复洗涤滤饼层，放入40 ℃真空干燥箱内干燥，得到淡黄色固体，即双水杨醛缩乙二胺（C₁₆H₁₆O₂N₂），测定其熔点为127.2~127.8 ℃，与文献值一致^［

29］。

图4 Cu(Salen）配合物的合成路线

Fig. 4 Synthesis route of Cu(Salen) complex

添加50 mL N，N-二甲基甲酰胺和13.4 g C₁₆H₁₆O₂N₂于烧瓶内，60 ℃下搅拌至固体完全溶解后滴加15 mL硫酸铜溶液，加热1 h。冷却后将反应液缓慢滴加至40 mL蒸馏水中析出沉淀，过滤后用乙醇溶液反复洗涤沉淀。最后经真空干燥得到墨绿色晶体Cu（Salen）。

Cu（Salen）配合物的X射线衍射（XRD）谱图如图5所示，其中A为实验室合成的Cu（Salen）配合物的XRD谱图，B为晶体结构数据库中标准样品的XRD谱图，根据谱图对比分析可知实验谱图与标准谱图基本一致。

图5 Cu(Salen)配合物的XRD谱图

Fig. 5 XRD spectra of Cu(Salen) complexes

A：实验样品；B：标准样品

1.4　CEL仿酶降解和乙酰化处理

1.4.1　GIF型仿酶体系降解CEL

在100 mL的锥形瓶中加入20 mg吡啶、20.4 mg硫酸铜、0.6 mL H₂O₂、10 mL蒸馏水及300 mg纯化后的CEL，在55 ℃下水浴振荡2 h，离心分离不溶物并用蒸馏水洗涤，冷冻干燥，得到GIF型仿酶降解产物GIF-CEL。

1.4.2　Cu（Salen）型仿酶体系降解CEL

在100 mL的锥形瓶中加入7.5 mL吡啶、5.4 mg Cu（Salen）配合物、300 mg纯化后的CEL、0.45 mL H₂O₂、8 mL蒸馏水，在70 ℃下水浴加热2.5 h，反应结束后离心分离不溶物，蒸馏水充分洗涤后冷冻干燥，得到Cu（Salen）型仿酶降解产物Cu（Salen）-CEL。

1.4.3　仿酶降解产物的乙酰化处理

仿酶处理后，CEL组分中部分易降解的木质素被溶出，剩余的残余物中含有结构较稳定且分子质量较高的木质素及LCC组分，其溶解性较差，需要对其进行乙酰化处理^［

30］，碱抽提所得CEL经乙酰化后可显著提高其溶解度^{［参考文献 31

百度学术}31］。室温下将150 mg降解产物溶解在7 mL的DMSO和N-甲基咪唑（2∶1，V/V）混合溶液中并搅拌12 h，结束后加入2.5 mL的乙酸酐，室温下搅拌3 h，最后将混合物倒入10倍体积的蒸馏水中，经离心分离、冷冻干燥后得到乙酰化仿酶降解产物Ac-GIF-CEL和Ac-Cu（Salen）-CEL。整个处理过程中的溶剂和乙酰化基本不影响后续测定结果^{［参考文献 32

百度学术}32］。

1.5　仿酶降解前后分子质量测定

凝胶渗透色谱法是测定木质素分子质量的一种常用方法^［

33］，本实验采用高效液相色谱仪（HPLC-20AT，日本岛津有限公司）测定仿酶降解前后样品的相对分子质量。称取样品CEL、GIF-CEL和Cu（Salen）-CEL各2 mg，溶解于1 mL的N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液中，溶解后的样品经有机膜（0.22 μm孔径）过滤，以含LiCl（0.1 mol/L）的DMF溶液作为流动相，流速1 mL/min。色谱柱选择Styragel^® HR 4E DMF（7.8×300 mm）。

1.6　仿酶降解产物的NMR测定

仿酶降解产物GIF-CEL和Cu（Salen）-CEL经乙酰化后，分别溶解于0.6 mL的DMSO-d₆中（130 mg/mL，用于¹H NMR和¹³C NMR测定）。300 K下，在Bruker Avance Ⅲ 600 MHz波谱仪上进行测定，¹³C NMR测定脉冲延迟2.5 s，采集时间0.95 s，累积扫描13000次。¹H NMR测定延迟时间为4.2 s，采集时间0.72 s，累积扫描500次。化学位移参考溶剂信号δ（¹H）=2.5，δ（¹³C）=39.5。

2 结果与讨论

2.1　仿酶降解前后CEL的分子质量分析

从表1可知，由于仿酶处理后CEL中的木质素和LCC被降解，样品分子质量下降。比较两种仿酶体系降解木质素和LCC的效果，Cu（Salen）型仿酶要比GIF型仿酶效果更好。GIF型仿酶体系处理后CEL的Mw从3.03×10⁴下降至3.58×10³，而经Cu（Salen）型仿酶体系处理后，下降到2.45×10³。经仿酶处理后，样品的分子质量分布系数（Mw/Mn）均减小，说明木质素和LCC被部分降解后，样品的分布更加集中。

表1 降解前后CEL的分子质量变化

Table 1 Change of molecular weight of CELs before and after treatment

样品	Mw	Mn	Mw/Mn
CEL	3.03×10⁴	1.57×10⁴	1.93
Ac-GIF-CEL	3.58×10³	2.05×10³	1.75
Ac-Cu(Salen)-CEL	2.45×10³	1.46×10³	1.68

2.2　Ac-GIF-CEL的¹³C NMR波谱分析

对经α-¹³C/6-²H标记的GIF-CEL以及未标记对照样品的¹³C NMR波谱（图6）进行分析，分析过程中以55.7（No. 22）处甲氧基的信号峰为基准^［

34］。如图6所示，化学位移174.56（No. 1）和172.09（No. 2）处的信号是乙酰基、肉桂酸、苯甲酸结构中—COO—上的碳原子共振产生^{［参考文献 35

百度学术}35］，α-¹³C标记后No. 2的信号显著增强，其信号与Cα位的羰基有关。α-¹³C标记样品的信号在化学位移149.52（No. 5）处有明显增强，这来自于α-C醚化的G型木质素单元上的C3/C4、β-芳基醚上的C4、肉桂醛中的Cα引起的共振，说明样品中存在肉桂醛结构。化学位移147.45（No. 6）处与阿魏酸和肉桂酸中的Cα相关，同位素标记后未有明显的信号变化，说明经GIF仿酶处理后残余木质素中阿魏酸和肉桂酸含量较少。经α-¹³C标记后，化学位移129.82（No. 8）处的信号明显增强，其来自愈创木基侧链（—CαH=CH—）结构中Cα的信号^{［参考文献 36

百度学术}36］，这可能是由于GIF型仿酶在降解木质素的过程中松伯醇结构未能完全降解。化学位移104.10（No. 13）处是与碳水化合物以缩醛键相连的木质素侧链上Cα的信号^{［参考文献 17

百度学术}17］，Cα经¹³C标记后此处信号略有增强，表明GIF型仿酶体系对缩醛键型连接的LCC结构影响不显著。化学位移87.87（No. 16）处为苯基香豆满结构（β-5）中Cα的共振信号，α-¹³C标记后有明显的增强。化学位移81.85（No. 17）为以苯甲醚键连接的LCC的Cα的信号^{［参考文献 37

百度学术}37］，α-¹³C标记后也有一定程度的增强，说明GIF型仿酶系统不能彻底水解苯甲醚键连接的LCC结构。化学位移71.48（No. 18）处的信号可归属于木质素β-O-4连接结构中的Cα，可见经GIF型仿酶系统处理后残余物中β-O-4连接结构含量较少，这与欧国隆等^{［参考文献 38

百度学术}38］的研究结果一致。62.17（No. 21）处信号是由木质素β-1连接结构中的Cα引起的，此处信号较弱说明GIF仿酶降解后β-1连接结构含量较少。

图6 银杏Ac-GIF-CEL样品的¹³C NMR谱图

Fig. 6 ¹³C NMR spectra of ginkgo Ac-GIF-CEL samples

a： α-¹³C/6-²H标记样品； b：未标记样品

2.3　Ac-GIF-CEL的¹H NMR波谱分析

图7为GIF-CEL中被²H标记和未标记的残余木质素之间的¹H NMR差示谱图（未标记的谱图减去²H标记的谱图）。除乙酰基上甲基的共振信号外，所有碳水化合物结构单元的共振信号均出现在3.0~5.5的区域，不同碳水化合物残基的乙酰基被取代后，其共振信号在该区域部分重叠^［

39］，但²H标记可以显著减少信号的重叠。化学位移2.29~1.88（No. 7、No. 8、No. 9）处的信号是乙酰化反应后乙酰基上的H共振产生的^{［参考文献 19

百度学术}19］。化学位移4.83~4.47（No. 1）处的增强信号是苄基化葡萄糖单元上6-D和6-D'的共振信号^{［参考文献 16

百度学术}16］，说明GIF仿酶处理后仍然有少量木质素和纤维素以苯甲醚键连接，计算其积分面积可知，木质素与纤维素以苯甲醚键连接的结构大约占6.7%。化学位移4.10~4.00（No. 2）、3.95~3.67（No. 3）处的信号峰为带有酯键的纤维素上6-D和6-D'的信号^{［参考文献 35

百度学术}35］。由于CEL经硫酸盐法蒸煮后酯键完全降解，此信号的形成是由于乙酰化过程中乙酰基与碳水化合物的C-6位形成了新的酯键。未取代纤维素上6-H和6-H'的共振在3.62~3.56（No. 4）和3.55~3.47（No. 5）处产生了微弱信号，说明GIF型仿酶处理CEL后的残余物中含有少量不含苯甲醚键的纤维素组分，其可能与木质素之间存在其他连接形式的LCC键。由于GIF体系不能有效断裂木质素和纤维素之间的化学键连接，GIF型仿酶处理无法彻底去除CEL中的纤维素物质。任颖等^{［参考文献 40

百度学术}40］发现Fe-CA/H₂O₂仿酶体系能部分降解浆料中的纤维素和聚木糖生成可溶性低聚糖，但并未降解成单糖。

图7 银杏Ac-GIF-CEL样品¹H NMR差示谱图

Fig. 7 ¹H NMR differential spectrum of ginkgo Ac-GIF-CEL samples

2.4　Ac-Cu（Salen）-CEL的¹³C NMR波谱分析

采用Cu（Salen）型仿酶体系处理CEL，对降解后残余木质素的¹³C NMR谱图进行分析，并通过与GIF型仿酶体系的降解产物对比，探讨GIF仿酶体系和Cu（Salen）型仿酶体系的降解效果和残余物的化学键变化。图8为Cu（Salen）型仿酶体系处理α-¹³C/6-²H同位素标记与未标记的硫酸盐浆所得残余木质素的¹³C NMR谱图。以化学位移55.8（No. 13）处的甲氧基为基准峰，与未标记物的谱图相比^［

29］，同位素标记物谱图在化学位移174.6（No. 1）、172.1（No. 2）和170.4（No. 3）处的信号归属于—COO—^{［参考文献 41

百度学术}41］，其增强部分来自苯甲酸中羧基的Cα。化学位移151.1（No. 4）处的信号经¹³C标记后明显增强，此处的信号主要归属为肉桂醛中的Cα以及愈创木基中的C3和C4^{［参考文献 42

百度学术}42］。化学位移129.68（No.5）处的信号来源于愈创木基侧链（—CαH=CH—）结构中的Cα，与GIF仿酶处理后残余物的结果相一致，说明两种仿酶体系均无法降解木质素侧链上的—CαH=CH—结构。

图8 银杏Ac-Cu(Salen)-CEL样品的¹³C NMR波谱图

Fig. 8 ¹³C NMR spectra of ginkgo Ac-Cu(Salen)-CEL samples

a： α-¹³C/6-²H标记样品； b：未标记样品

化学位移62.16（No. 12）的信号主要来自木质素β-1连接结构上的Cα^［

43］，¹³C标记的残余物中该信号峰明显增强，与GIF仿酶降解后残余物的结果一致，说明两种体系的仿酶在降解后均残留少量β-1连接的缩合型木质素结构。Cu（Salen）型仿酶降解后在化学位移104和81.85处均未观察到共振信号，这说明Cu（Salen）型仿酶能够破坏木质素侧链上Cα与多糖间的缩醛键以及苯甲醚键的连接^{［参考文献 42

百度学术}42］。残余物中仅识别到—CH=CH—、β-O-4和少量的β-1连接结构，这表明LCC的连接结构含量极少。

2.5　Ac-Cu（Salen）-CEL的¹H NMR波谱分析

图9为经Cu（Salen）型仿酶处理6-²H标记的CEL后残余物与未标记样品的¹H NMR差示谱图。化学位移3.82~3.63（No. 1）处较强的信号是纤维素上未取代6-H和6-H'共振引起的，此信号说明残余物中仍存在纤维素组分^［

19］，表明Cu（Salen）型仿酶体系不能完全水解CEL中的纤维素组分。化学位移2.24~1.90（No.3）处同样出现了乙酰基的H信号，1.24~1.10（No.4）处出现了脂肪族的H信号。化学位移4.83~4.38区域内未发现与葡萄糖单元以苯甲醚键连接的6-D和6-D'的相关信号^{［参考文献 44

百度学术}44］，说明Cu（Salen）型仿酶降解残余物中的纤维素组分与木质素以非苯甲醚键的形式连接。

图9 银杏Ac- Cu(Salen)-CEL样品的¹H NMR差示谱图

Fig. 9 ¹H NMR differential spectrum of ginkgo Ac-Cu(Salen)-CEL samples

3 结论

为了深入研究硫酸盐浆中残余木质素的仿酶降解机理，本研究用松伯醇葡萄糖苷-［α-¹³C］及碳水化合物多糖前驱物D-葡萄糖-［6-²H₂］对银杏的新生木质部进行了双同位素标记，经硫酸盐法制浆后从纸浆中分离得到纤维素酶解木质素（CEL），并采用GIF型和Cu（Salen）型仿酶体系降解处理，结合¹³C NMR和¹H NMR技术分析残余木质素结构及其与LCC的化学键连接形式。

3.1　GIF型和Cu（Salen）型仿酶体系降解CEL样品前后的分子质量变化显示，两种仿酶体系处理后残余物的分子质量均有所减少，GIF型仿酶体系处理后CEL的Mw从3.03×10⁴下降至3.58×10³，而经Cu（Salen）型仿酶体系处理后，下降到2.45×10³。说明两种仿酶体系均可以降解CEL，并且Cu（Salen）型仿酶体系对CEL的降解效果更好，表明Cu（Salen）型仿酶体系在深度脱除木质素方面具有较好的应用前景。

3.2　¹³C和²H双同位素标记Ac-GIF-CEL的¹³C NMR谱图表明，GIF型仿酶体系处理CEL后，残余物中木质素结构单元主要以β-5、β-O-4、β-1结构连接，此外还存在着侧链双键结构—CαH=CH—，残余木质素与纤维素间存在缩醛键和苯甲醚键连接。¹H NMR差示谱图显示残余物中约6.7%的木质素与纤维素以苯甲醚键连接，并且存在部分与木质素以其他LCC连接键结合的纤维素。

3.3　¹³C和²H双同位素标记Ac-Cu（Salen）-CEL的¹³C NMR谱图表明，Cu（Salen）型仿酶体系处理CEL后，残余物中木质素结构单元以β-O-4、β-1结构连接，还存在着侧链双键结构—CαH=CH—，未发现木质素和碳水化合物之间的苯甲醚键和缩醛键的连接键，说明相比于GIF型仿酶，Cu（Salen）型仿酶降解LCC的能力较强。¹H NMR差示谱图也显示存在少量以非苯甲醚键结合的纤维素，说明用上述仿酶处理不能完全降解木质素和纤维素之间的连接键。

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13C-2H双同位素示踪法研究硫酸盐浆中残余木质素的仿酶降解

摘要

关键词

1 实 验

1.1 实验试剂及原料

1.2 CEL的制备与纯化

1.3 Cu（Salen）配合物的合成

1.4 CEL仿酶降解和乙酰化处理

1.5 仿酶降解前后分子质量测定

1.6 仿酶降解产物的NMR测定