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天然高分子自组装包埋单细胞在生物医学领域的应用

  • 贺斌 1,2
  • 方一帆 1,2
  • 成琳 1,2
  • 郑旭磊 1,2
  • 王科尧 1,2
  • 朱兴 1,2
  • 宋顺喜 1,2 ✉
1. 陕西科技大学轻工科学与工程学院,陕西西安,710021； 2. 陕西科技大学轻化工程国家级实验教学示范中心,陕西西安,710021

中图分类号： TS7

最近更新：2024-03-25

DOI：10.11981/j.issn.1000-6842.2024.01.114

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摘要

利用层层自组装法制备天然高分子功能材料，具有操作简单、反应条件温和、壳层结构易调等特点，近年来已成为热点研究方向之一。基于此，本综述总结了利用淀粉、壳聚糖、海藻酸钠、明胶、纤维素等天然高分子，通过层层自组装法制备单细胞壳层的策略，讨论了自组装过程对细胞活性、pH耐受性等性能的影响，为固定化细胞在生物医学领域中的应用提供参考。

近年来，细胞在生物医学领域的应用成为研究热点。但由于应用环境的复杂性，对于需要保持活性才能发挥功效的细胞而言，如何保证输送过程和应用环境中的细胞活性是亟需解决的问题。研究人员从自然界细菌内生长孢子和植物休眠种中得到启发——外表的孢子外壳或种皮可以为内部细胞提供稳定的保护作用以抵御不利的环境条件，即隐生现象，并由此提出了“壳内细胞”结构，即“人工孢子”，一类由单细胞包埋策略产生的细胞混合新体系［

1］。

单细胞包埋方法包括生长法和沉积法。生长法是利用自由基聚合的原理，在细胞表面逐渐“生长”出聚合物壳层，从而实现单细胞包埋的方法；聚合方法主要包括原子转移自由基聚合（Atom Transfer Radical Polymerization，ATRP）和可逆加成断裂链转移聚合（Reversible Addition-fragmentation Chain Transfer Polymerization，RAFT）等受控自由基聚合［

2］，以及表面引发聚合［3］。沉积法可以将物质（小分子、纳米颗粒和聚合物等）通过物理化学作用，直接沉积在细胞表面，通过重复沉积步骤改变制备的壳层厚度；典型的沉积法为层层（layer-by-layer，LBL）自组装法［4］，即通过阴/阳离子聚电解质在细胞表面依次吸附，形成壳层，从而实现对细胞的包埋。随着对细胞包埋的研究不断深入，操作简单、反应条件较温和的LBL自组装单细胞包埋法得到了广泛关注［5-8］。Drachuk等［9］提出了“半人工细胞”的概念，以描述聚合物及纳米材料通过LBL自组装制备细胞壳层的策略。

聚电解质一般通过LBL自组装形成纳米层结构，经与其带相反电荷的物质络合，所得壳层通常表现出更好的机械完整性，且具有一定牢固性、耐久性及选择渗透性［

10］。其中，壳层的牢固性可以抵抗外部机械应力，如渗透压力和脱水引起的应力等；同时，在这些应力下，壳层可以帮助细胞保持原始结构与活性；壳层的牢固性通常也体现在耐久性上，即壳层可以通过抵抗生物力，在一定程度上控制细胞生长和分裂。此外，壳层具有一定的选择渗透性，可以在阻挡有害大分子物质进入细胞的同时，使小分子物质如氧气、葡萄糖等顺利通过，以满足细胞存活所需的必要营养物质等条件［11］。Ai等［12］通过LBL自组装法，使用聚电解质在单个血小板上构建聚合物纳米层，并应用于靶向药物输送。此后，使用聚电解质在细胞表面逐层构筑壳层的自组装方法被广泛研究［13-16］。

随着对聚电解质LBL自组装壳层的深入研究，可包埋细胞的种类也随之增加，包括酵母、细菌、益生菌等。由于合成聚电解质的细胞毒性较强，天然聚电解质凭借其易获得、易降解、低细胞毒性和高生物相容性等优势，逐渐成为单细胞包埋的首选材料［

17-19］。本文重点介绍以天然高分子材料为聚电解质，通过LBL自组装实现单细胞包埋的方法，并讨论其在生物医学领域中的应用。

1 LBL自组装技术

1.1　LBL自组装原理

LBL自组装是利用静电、氢键等相互作用，在基底表面形成聚合物薄膜或得到聚合物壳层（以下统称LBL层）的方法。在该方法中，2种带相反电荷的聚电解质之间的静电相互作用是构建LBL层的主要作用机制。由于基底表面具有电负性，可以在其表面沉积相反电荷作为第1层，然后交替沉积聚阳离子层、聚阴离子层，直到聚合物纳米涂层达到所需层数；在每一层沉积后，需要洗涤去除未结合的聚电解质。此外，氢键作用也可以用于构筑LBL层。对基于氢键协同静电机制的多层自组装过程，第1层聚合物可通过与基底表面之间的静电和氢键作用沉积，然后再通过层与层之间的静电和氢键作用沉积其他聚合物［

20］。

将LBL自组装技术应用于细胞上，制备流程与上述类似，即利用静电作用机制，在细胞表面反复沉积阴/阳离子聚电解质，以实现单细胞包埋（如图1（a）所示）。在构建用于细胞封装的聚电解质多级纳米壳层时，静电作用是最常用的驱动力（如图1（b）所示）。此外，带疏水烷基链的两亲性聚合物可以通过疏水相互作用，锚定到脂质双层细胞膜中［

21］。因此，在后续层与层之间的沉积过程中，以静电驱动力为主导作用，通过氢键、疏水等协同作用能够促进LBL自组装材料的制备，以实现多种用途。

图1  LBL静电自组装示意图[

21]

Fig. 1  Schematic diagrams of LBL self-assembly via electrostatic interaction[

21]

1.2　LBL自组装壳层的调控策略

LBL自组装法在包埋化学及生物物质方面已得到广泛研究。相较于其他包埋方法，LBL自组装结构及性能的调控可以通过调整工艺参数实现，包括壳层材料种类、介质离子强度、pH值等。Luo等［

22］发现正电荷的纳米颗粒制剂不会导致癌细胞活力的显著降低，而使用非离子聚合物（聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷）LBL包埋山奈酚可显著降低癌细胞活力；由此可见，通过改变壳层材料种类，可以调控LBL自组装材料的性能。Tang等［23］发现聚电解质LBL自组装膜在逐层形成过程中，随着介质NaCl溶液浓度从0.001 mol/L升高至1 mol/L，LBL自组装膜厚度从线性生长变为指数生长，因此可通过改变介质离子强度，制备不同厚度的LBL层。Szabó等［24］使用氧化石墨烯/阳离子聚电解质（聚二烯基二甲基氯化铵）LBL自组装制备薄膜，在不同pH值和离子强度条件（酸性、碱性和盐水）下均具有较高的稳定性；同时，LBL层厚度可根据沉积次数进行调控。综上所述，基于LBL自组装技术可定制多级壳层的结构和功能，使被包埋细胞在不同领域中得到应用，如生物传感器、细胞治疗、药物输送等［25］。因此，LBL自组装技术在细胞包埋中具有较高的应用价值。天然高分子材料通过LBL自组装可用于单细胞包埋，该技术已被广泛关注和研究，相关研究应用如表1所示。

表1  LBL自组装技术在单细胞包埋中的应用
Table 1  Application of LBL self-assembly technique in single-cell encapsulation
细胞/菌株聚阳离子电解质聚阴离子电解质参考文献
小鼠神经干细胞，小鼠成牙本质细胞，毛囊干细胞 A型明胶 海藻酸钠 [26-28]
海拉细胞 酰胺化A型明胶 B型明胶 [29]
海拉细胞，小鼠胰岛瘤细胞 酰胺化A型明胶 B型明胶 [30]
神经细胞株 A型明胶 透明质酸 [31]
酿酒酵母细胞 季铵化淀粉 海藻酸钠 [32]
小鼠成纤维细胞，间充质干细胞 酰胺化丝素蛋白 羧基化丝素蛋白 [33]
小鼠成肌细胞，人脐静脉内皮细胞，人肝癌细胞，小鼠成纤维细胞，毛囊细胞 牛血浆纤维连接蛋白（FN） 明胶 [5-8]

2 高分子材料LBL自组装包埋单细胞的生物医学应用

通过LBL自组装技术，天然高分子材料可在单细胞表面形成多功能性壳层，这一策略目前广泛应用于生物医学领域，包括细胞递送和组织工程等。通过改变壳层沉积次数和材料性质，可以调节壳层的物理化学性质，不仅能够保护包埋细胞免受外部环境刺激，而且为组织工程中，单细胞表面纳米结构的构建提供新的策略。本文重点介绍可用于LBL自组装法包埋单细胞的天然高分子材料，及其在细胞递送和组织工程中的生物医学应用。

2.1　细胞递送

近年来，益生菌在调节人类健康和疾病方面的研究取得了较大进展［

34］。然而，益生菌在胃肠道运输过程中，受酸性胃液和胆汁的影响，会迅速失去细胞活力。通过LBL自组装技术对益生菌进行封装，可以最大程度保持递送过程中的益生菌活性，同时实现定点可控释放。多糖类材料（如淀粉、壳聚糖、纤维素）因其自身具备一定的黏附特性，可应用于益生菌的体内肠道定植。

2.1.1　壳聚糖

甲壳素是一种存在于天然材料中的多糖类高分子材料，壳聚糖（CS）可由甲壳素脱乙酰化生成［

35-38］。由于不完全脱乙酰化，少数壳聚糖大分子呈乙酰化形式（N-乙酰基葡糖胺）。胺官能团的存在使CS呈弱碱性。在LBL自组装过程中，CS可以与海藻酸钠（ALG）上的酸性残留物通过静电相互作用沉积。因此，CS和ALG可以经LBL沉积，实现单细胞包埋。由于CS和ALG均具有生物相容性与独特的黏附特性，CS/ALG壳层被广泛应用于益生菌体内输送［39］。

Anselmo等［

40］使用阳离子CS和阴离子ALG作为原料，通过静电相互作用在益生菌菌株凝结芽孢杆菌（BC）上依次沉积3个双层（CS/ALG）3，发现BC经3个双层包埋后，其指数增长阶段延迟至10 h以上，即进入对数生长期的阈值；因此选用2个双层（CS/ALG）2包埋BC继续进行实验。在模拟胃肠液的生物荧光素耐受性测试中，当BC包埋在（CS/ALG）2中时，处理2 h后菌落形成单位（CFU）损失不到1个对数单位，继续处理后损失不到2个对数单位；而游离BC在模拟胃液中几乎完全死亡。在肠道黏附性实验中，经口灌胃递送相同数量的BC，给药1 h后，与游离BC相比，包埋BC在胃肠道内的信号提高了6倍（如图2所示），这是由于CS与ALG自身具有一定的黏附性，可顺利黏附在肠道中并释放BC。这项研究发现，CS/ALG可同时提高益生菌在模拟胃肠液中的存活率，并促进其在肠道组织黏膜上的黏附和生长，解决了益生菌特异性口服给药时，多数益生菌不能顺利通过胃液抵达作用部位的挑战。Cook等［41］使用CS和ALG在短双歧杆菌表面构筑了LBL层。结果表明，壳层在低pH值下可为短双歧杆菌提供保护作用，提高了短双歧杆菌存活率，并将其成功运送到肠道部位。然而在模拟胃肠液的耐受性实验中，研究人员发现，包埋超过3个双层的短双歧杆菌存活率下降；这是由于随着CS、ALG交替沉积次数逐渐增加，壳层材料会出现溶胀现象，交替沉积至5个双层时，壳层材料体积增加至原始的（130.61±21.16）%。壳层的溶胀程度增加会使交联密度降低，导致更多的胃酸透过壳层，使益生菌存活率降低。Kamalian等［42］研究了不同材料（CS、ALG）在模拟胃肠液中对双歧杆菌的生存能力和释放行为的影响，分别制备了CS/ALG、ALG胶囊包埋的双歧杆菌。结果表明，在模拟胃肠液环境中，CS/ALG胶囊比单一组分ALG胶囊更耐模拟胃肠液环境，双歧杆菌的存活率也更高。

图2  包埋前后BC经口灌胃1 h后的荧光成像[

40]

Fig. 2  Fluorescence images of BC before and after encapsulation by oral gavage for 1 h[

40]

此外，ALG分子可以与Ca2+、Zn2+等离子结合，实现分子间相互交联以达成细胞包埋；这是因为Ca2+、Zn2+可取代ALG分子链中与羧基相连的阳离子，同时侧链也可与Ca2+、Zn2+螯合相连，从而形成交联“蛋盒”结构（如图3所示）［

43］。基于这一性质，在使用挤出法进行细胞包埋的研究中，ALG表现出较好的稳定性，使用较为广泛。在LBL自组装方面，也可利用这一性质将ALG包覆于最外层，并使用Ca2+、Zn2+进行交联，起到壳层加固的作用，以增强壳层对细胞的保护。Yao等［44］通过使用CS和ALG对唾液乳杆菌（Li01）进行了2个双层包埋，在Ca2+/Zn2+溶液中对最外层ALG进行交联加固（LBL-Li01），通过检测包埋前后Li01在模拟胃肠液中120 min后的活性，发现LBL-Li01存活率分别下降了1.2和3.0个对数单位，而游离Li01存活率分别下降了3.9和6.2个对数单位，说明Ca2+加固后的壳层可以进一步提高对细胞的保护作用。在小鼠结肠炎症的治疗过程中，与其他治疗条件下的小鼠相比，LBL-Li01处理的小鼠损伤明显较低，表明LBL-Li01可促进结肠上皮细胞的快速修复。

图3  ALG凝胶化的蛋盒模型[

43]

Fig. 3  Model of an egg carton for alginate gelation[

43]

综上所述，因良好的生物相容性、易操作性等优势，CS、ALG在益生菌的包埋输送领域被广泛使用，CS与ALG独特的肠道黏附性及协同作用也为益生菌的人体输送及释放提供了良好的条件。但二者也存在随着壳层数增加，壳层溶胀程度增加的缺点，易导致LBL层对益生菌保护能力降低的问题。针对这一问题，可用Ca2+/Zn2+对ALG作用下形成的LBL层进行加固，以严格控制和防止益生菌的提前释放，避免益生菌暴露在不利的外部环境中。

2.1.2　纤维素衍生物

羧甲基纤维素（CMC）是以羧甲基取代羟基的醚类纤维素，是一种阴离子聚合物；由于高黏性和低毒性，在制药领域被广泛用作粘黏聚合物［

45］，其与黏蛋白可形成氢键相互作用，因此具有优异的黏膜吸附特性，在LBL自组装技术包埋细胞领域是常用的天然聚电解质之一。纤维素是由β-1，4-D-葡聚糖构成的天然聚合物，具有可降解性及亲水性，在基于LBL自组装技术进行细胞包埋的生物医学应用领域也是理想的候选材料［46］。

Priya等［

47］通过聚电解质壳聚糖（CS）和CMC的逐层自组装，制备了3层壳层（CS/CMC）1.5，实现了对嗜酸乳杆菌的包埋（如图4所示），以提高其在胃肠道中的存活率。在模拟胃液中处理120 min后，未包埋嗜酸乳杆菌数量从10.4 logCFU/500 mg的初始计数下降到4.0 logCFU/50 mg，在相同条件下，包埋嗜酸乳杆菌数量从9.4 logCFU/500 mg下降到8.2 logCFU/50 mg，下降幅度明显较小；未包埋嗜酸乳杆菌暴露于模拟胃液120 min后，继续暴露在模拟肠液中120 min，存活率约1.0 logCFU/500 mg，但在相同条件下，包埋嗜酸乳杆菌存活率约6.3 logCFU/500 mg。这是由于（CS/CMC）1.5层对引起蛋白水解的酶分子（如胃蛋白酶和胰蛋白酶）具有阻挡作用，从而使其在胃肠道环境中具有一定稳定性。

图4  聚电解质在嗜酸乳杆菌表面的LBL自组装流程图[

47]

Fig. 4  Flow diagram of LBL self-assembly of polyelectrolytes on the surface of Lactobacillus acidophilus[

47]

然而，有研究发现将纤维素及其衍生物包埋细胞移植体内可能会引起炎症。因此，应深入阐明纤维素的基本特性以拓展纤维素封装的未来应用。此外，大量氢键的存在导致纤维素溶解性差［

48］等问题，也限制了纤维素及其衍生物通过LBL自组装技术在包埋细胞领域的应用。

2.1.3　淀粉

淀粉是一种来源丰富、可生物降解、可再生、无毒且廉价的天然高分子，可作为填料降低产品中的水分含量，以提高产品稳定性，亦可通过LBL自组装在细胞表面，为细胞提供物理屏障，同时可用作微生物的碳源，进而为细胞的生存与生长提供合适的微环境［

49-51］。但天然淀粉的电荷密度较低，常采用与缩水甘油三甲基氯化铵（GTA）功能化来提高其电荷密度，即将GTA通过碱催化的开环反应接枝到淀粉主链上，使淀粉主链引入氮甲基而带正电荷。此种改性方法可以通过改变取代度来改变改性淀粉的正电位强度（如图5所示）［52-54］。除了上述常用的引入氮甲基法外，也可以通过在淀粉主链上引入羧甲基、偶氮基、酰胺基等改性方法来提高淀粉正电荷密度［53-56］。

图5  季铵化淀粉改性机理[

52-54]

Fig. 5  Mechanism of quaternary ammonium starch modification[

52-54]

Moon等［

32］使用季铵化淀粉（QS）和海藻酸钠（ALG）在酵母细胞表面LBL自组装，制备了由3个QS/ALG双层构成的多级壳层，实现了对酵母细胞的单细胞包埋，同时实现了壳层在α-淀粉酶作用下的快速降解，且不损害酵母细胞活性。用荧光素标记ALG，并通过激光共聚焦显微镜（CLSM）观察形成的壳层。结果表明，壳层呈现清晰的绿色环状，利用α-淀粉酶对壳层进行降解后，绿色环状荧光减弱；经QS/ALG包埋后的酵母细胞存活率仍达97.6%。因此，采用具有细胞相容性的材料，经LBL自组装可制备按需快速降解的LBL层，为需要体外降解和体内程序化溶解的生物医学应用提供了一条有前景的途径。

淀粉在细胞包埋过程中可以维持细胞活性；同时，采用多种改性方法将淀粉与其他材料共同用于细胞包埋，具有良好的可操作性。将淀粉用于LBL自组装技术实现包埋的研究较多，但主要集中在小分子、激素等物质的包埋与输送［

53，56-57］，对单细胞包埋和应用的研究较少。从长远来看，虽然包埋对象不同，但使用的技术原理具有高度一致性。因此将淀粉应用于单细胞包埋仍是一个具有研究价值和广阔前景的方向。

2.2　组织工程

细胞包埋的基本目的是为细胞提供保护，前文围绕这一目的对LBL自组装法包埋细胞进行了阐述，包括采用多种不同的天然高分子进行包埋，对材料进行多种方式改性以适用LBL自组装法等，展现了天然高分子材料的功能性和LBL层的结构可调性。与细胞外基质成分类似的天然高分子材料也可被用于模拟组织结构，并用于组织工程。这类材料不仅能维持包埋细胞的代谢活性和功能，还能调节细胞的增殖和分化，进一步有效减轻宿主免疫反应。其中，明胶等天然高分子材料被广泛用于在细胞表面构建仿生外壳，其可以在保证各类细胞被成功递送的同时，提供良好的相容性条件，从而形成仿生组织。

采用不同的方法可制备获得2种亚型的明胶，酸性预处理后提取可得到A型明胶，等电点为6.0~9.0；碱性预处理后在中性条件下提取可得到B型明胶，等电点为4.7~5.4。A型明胶在中性条件下呈正电性，可直接与呈负电性的细胞膜结合，用于细胞包埋领域［

58-60］。同时，明胶是胶原在酸、碱、酶或高温作用下的变性产物，与胶原一样由18种氨基酸组成，具有良好的生物相容性，可用于模拟细胞外基质，对组织工程具有重大意义。

Yang等［

29］通过LBL自组装明胶内层，通过硫醇点击化学交联聚乙二醇（PEG）外层，实现单个哺乳动物细胞的内外层纳米封装。研究人员首先将A型氨基阳离子明胶（GA）［61］与阴离子B型明胶（GB）利用静电作用在海拉细胞表面自组装（LBL-海拉），在沉积了3层GA、2层GB后，再在表面交联PEG外层（LBL-PEG-海拉）。结果表明，封装的单个海拉细胞显示出较高活力，在高速离心作用下能有效保护细胞，且经3天贮存后，壳层仍未解离，具有较强的耐久性（如图6所示）。此外，也可以通过选择性切割外部PEG层中的琥珀酰亚胺硫醚键来实现按需释放。Kadowaki等［62］使用明胶和牛血浆纤维连接蛋白（FN），通过LBL自组装法，在小鼠成纤维细胞表面制备纳米尺寸的多层膜（FN-G），以控制细胞表面微环境和形态，提高细胞生存能力，维持细胞增殖活性。与合成聚电解质聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚苯乙烯磺酸盐制备的壳层（PDADMAC/PSS）相比，FN-G包埋的细胞可正常分裂增殖，而PDADMAC/PSS包埋的细胞未观察到增殖现象。由此表明，天然高分子材料的使用更有利于维持细胞自身活性和机能。

图6  明胶包埋单个海拉细胞的壳层耐久性及细胞活性变化[

29]

Fig. 6  Changes in shell durability and cell activity of single HeLa cells embedded in gelatin[

29]

Zhang等［

63］将谷丙转氨酶锚定在细胞膜的外表面，催化明胶交联，进而实现对单个间充质干细胞（MSC）的包埋，在移植3天后，包埋MSC存活率比未包埋MSC高6倍，体内移植MSC的外层水凝胶在14天后可降解。研究发现，明胶层可通过维持线粒体的完整性和功能性，避免MSC在作用区域中缺氧和缺血凋亡，通过控制外层明胶交联程度，可对壳层机械性能、包埋细胞的分化能力等性能进行调控；小鼠心脏梗死治疗实验结果表明，明胶包埋MSC治疗后的心脏切片梗死面积小于未包埋MSC。Matsusaki等［7］使用LBL自组装法在单个细胞的表面制备纳米尺寸的FN-明胶膜，并制备了异种细胞多层结构（如图7（a）所示）。Nishiguchi等［8］报道了利用FN-明胶纳米膜的LBL层包裹不同细胞，通过细胞堆积，快速构建具有内皮管网络结构的3D多层组织。这种简单快速的技术将有希望用于构建组织工程的仿生组织（如图7（b）所示）。

图7  明胶和FN经LBL自组装包埋单细胞。

Fig. 7  Gelatin and FN were assembled through LBL technique to embed single cells

明胶作为一种可以模拟细胞外基质环境的天然高分子材料，除了可直接包覆于细胞表面，提高细胞在模拟胃肠液中的耐受性，允许内容物的释放外，还能包埋各类细胞，为形成仿生细胞提供必要的条件，在组织工程方面具有良好的应用前景。

3 结语与展望

天然高分子，如壳聚糖、海藻酸钠、纤维素、明胶及淀粉等，具有来源广、储量大、生物相容性优良等优点，且上述天然高分子具有多种功能基团，可以较容易地使用多种化学、物理方法改性，通过静电等相互作用力，吸附在细胞表面，构筑壳层以为细胞提供保护作用，广泛应用于层层自组装法单细胞包埋领域的研究。

迄今为止，层层自组装包埋细胞的研究已经取得了显著的成果，但仍存在优化工艺参数以更快获得更稳定的壳层、保证壳层稳定以在胃肠液中为包埋物质提供更好的保护作用、在体外实现长期储存等多种挑战。利用层层自组装技术的通用性、壳层可定制性等特点，可开发具有优异性能的多功能仿生智能材料，以进一步发展天然高分子自组装包埋单细胞在生物医学领域的应用。综上所述，利用层层自组装技术进行单细胞包埋在生物医学领域具有巨大的潜力。

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